白癜风的治疗药物 http://disease.39.net/bjzkbdfyy/170816/5629059.html

摘要：目的制备及表征葛根素壳聚糖/海藻酸钠口服纳米粒（Pur-CS/SA-NPs），并进行药动学研究。方法采用自组装法制备Pur-CS/SA-NPs，对Pur-CS/SA-NPs混悬液和冻干粉的形态、粒径、多分散指数（PDI）、Zeta电位、包封率、载药量、微观结构等进行表征；建立葛根素LC-MS/MS分析方法，测定大鼠口服给予Pur-CS/SA-NPs后血浆中葛根素的浓度，考察其药动学特征。结果Pur-CS/SA-NPs混悬液和冻干粉的形态结构完整，其中Pur-CS/SA-NPs混悬液的粒径为（.±1.）nm，PDI为0.±0.，包封率为（89.±1.）%，载药量为（44.±0.）%，Pur-CS/SA-NPs冻干粉的粒径为（.±0.）nm，Zeta电位为（47.±0.）mV，包封率为（86.±0.）%，载药量为（43.±0.）%，无新化学键和晶体形成；Pur-CS/SA-NPs的药时曲线下面积（AUC0～24和AUC0～∞）、达峰时间（tmax）、达峰浓度（Cmax）分别为（.±.）mg?h/L、（.±.）mg?h/L、（1.±0.）h、（.±36.）mg/L，葛根素的AUC0～24、AUC0～∞、tmax、Cmax分别为（.±32.）mg?h/L、（.±28.）mg?h/L、（0.±0.）h、（.±17.）mg/L，Pur-CS/SA-NPs的AUC0～24、AUC0～∞、tmax、Cmax分别为葛根素的3.、3.、2.、1.倍。结论自组装法制备的Pur-CS/SA-NPs形态结构稳定，口服给药后药物在体内的AUC0～24、AUC0～∞、tmax均显著增大，循环时间也相对延长，显著提高了葛根素的生物利用度。

葛根素（puerarin，Pur）为葛根的主要生物活性成分之一，药理作用广泛，在心脑血管、肝脏损伤、肿瘤、糖尿病、骨坏死等疾病的预防和治疗中效果显著[1-4]。但葛根素溶解性差，渗透性低，被归为生物药剂学分类系统（BCS）IV类药物[5]，口服后大部分随粪便以原型形式排出[6]，仅有少部分吸收入血，分布到各组织器官[7]，生物利用度低。目前，国内批准的葛根素临床应用剂型只有注射剂和滴眼液，其注射剂需反复给药，用量大，患者服用不便，不良反应也屡见报道，如致敏、肝肾影响、休克、溶血反应等[8-9]，限制了其临床广泛应用。

纳米粒比表面积大，易于制备与修饰，能够提高药物的溶解性和渗透性[10-11]。采用自组装法制备的葛根素壳聚糖/海藻酸钠口服纳米粒（Pur-CS/SA-NPs），以口服的方式给药，提高患者的依从性，制备工艺简单，质量稳定，重复性强，易于大规模产业化生产。本实验对经过严格处方工艺考察的Pur-CS/SA-NPs[12]的微观结构、药物动力学性质等研究，建立完整的测定体内外葛根素LC-MS/MS的分析方法，简单快速，灵敏度高，重现性好，专属性高，结果准确。在所建立的色谱分离条件下，血浆中内源性杂质及代谢物不干扰样品测定。以期为葛根素新型给药系统的开发、临床应用及产业化生产等奠定基础。

1材料与仪器

葛根素对照品，中国食品药品检定研究院，生产批号-，质量分数＞95.5%；葛根素，成都普菲德生物技术有限公司，生产批号，质量分数＞98%；兰索拉唑，中国食品药品检定研究院，生产批号-，质量分数＞99.8%；壳聚糖，实验室自制，脱乙酰度＞99%；海藻酸钠（批号，CAS：-38-3，AlfaAesar公司；无水氯化钙，生产批号，国药集团化学试剂有限公司；色谱甲醇、色谱乙腈、色谱甲酸均为美国Tedia公司。

SQP万分之一分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Sigma3-18K高速冷冻离心机，德国Sigma公司；HH-4数显恒温水浴锅，上海江星仪器有限公司；Vortex-Genius3涡旋仪，IKA仪器设备有限公司；SZ-93自动双重纯水整流器，上海亚荣生化仪器厂；EPED-ESL-10TH超纯水仪，南京易普易达科技发展有限公司；BF-2氮气吹干仪，八方世纪公司；TECNALG2透射电子显微镜（TEM），美国FEI公司；Nano-S马尔文纳米粒度仪，英国马尔文公司；AgilentA1高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；ZNCL-BS*磁力搅拌器，西安远舰仪器设备有限公司；KQDA超声仪，昆山市超声仪器有限公司；PHS-25pH校准计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

实验动物SD大鼠，雄性，～g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（赣）-3。

2方法与结果

2.1Pur-CS/SA-NPs的制备[12]

精密量取壳聚糖储备液μL，加入超纯水4.6mL后混合均匀，用1%的稀盐酸和饱和氢氧化钠溶液调节壳聚糖溶液的pH值后标记为备用溶液A，用5%的乙醇溶液溶解10mg的Pur于5mL量瓶中，超声溶解后标记为备用溶液B。将备用溶液B缓慢加入备用溶液A中，搅拌混合均匀，标记为备用溶液C。另取50μL海藻酸钠储备液和μL氯化钙储备液于25mL烧杯中，在磁力搅拌器下缓慢加入超纯水9.85mL，搅拌10min超声10min，使海藻酸钠和氯化钙充分混合均匀，标记为备用溶液D。将备用溶液C通过1mL注射针管缓慢滴入备用溶液D中，边滴加边置于磁力搅拌器上搅拌，滴加完全后超声10min，超声结束后继续搅拌，至溶液显明显乳光。

其中，储备液的配制，分别精密称取壳聚糖、氯化钙、海藻酸钠.0mg于10mL量瓶中，用水定容至刻度，超声溶解后放冰箱冷藏备用。所制备的纳米粒平均粒径为（.±1.）nm、多分散指数（PDI）为（0.±0.）、包封率为（89.±1.）%、载药量为（44.±0.）%。

2.2Pur-CS/SA-NPs混悬液的表征

Pur-CS/SA-NPs混悬液澄清透明，有明显乳光，丁达尔效应明显。TEM显示，Pur-CS/SA-NPs形态圆整完好，均匀、分散性良好，没有粘连现象。自组装法制备的纳米粒电位均为正电位，纳米粒电位稳定，结果见图1。

2.3Pur-CS/SA-NPs冷冻干燥后的表征

2.3.1冻干后纳米粒形态、粒径与Zeta电位观察将Pur-CS/SA-NPs混悬液置于培养皿中，冷冻干燥后观察其形态[13-14]。取冻干后的纳米粒1mg，超纯水复溶至10mL，用马尔文纳米粒度仪测定粒径与Zeta电位，结果见图2。纳米粒冻干后质地细腻，粒径为（.±0.）nm，Zeta电位为（47.±0.）mV，冻干后纳米粒粒径和Zeta电位稳定。

2.3.2包封率和载药量的测定取冻干后的纳米粒1mg，超纯水复溶至10mL，取Pur-CS/SA-NPs混悬液μL置超滤离心管，于12r/min高速离心30min后取截留液，经0.22μm滤膜滤过。精密量取续滤液μL，甲醇定容至10mL，混匀，测定纳米粒的包封率及载药量。结果如表1所示，自组装法制备的纳米粒冻干后的包封率为（86.±0.）%，载药量为（43.±0.）%，与纳米粒混悬液之间并无显著性差异。

包封率＝(C－C1)/C

载药量＝W1/(W1＋W2)

C为混悬液中总的Pur的质量浓度，C1为混悬液中未包封的药物的质量浓度，W1为包封的药物的质量，W2为所有辅料的质量

2.3.3X射线衍射分析（XRD）釆用XRD研究葛根素在纳米粒中的晶态改变[15]。分别取Pur-CS/SA-NPs冻干品、壳聚糖、海藻酸钠、葛根素各10mg，Cu靶、石墨单色器，Sc探测器，满标为cps。扫描速度40°/min，管压为40kV，管流mA，取样间隔2°/min，衍射角6°～40°。XRD结果如图3所示。由XRD可知，葛根素本身存在多个晶体衍射峰，在壳聚糖、海藻酸钠中，壳聚糖存在一定的晶体衍射峰，但自组装法制备的纳米粒经过XRD，并不存在晶体衍射峰，且葛根素的晶体衍射峰完全消失，表明葛根素已基本被包裹或吸附完全，不具有晶体结构，形成了新物相，其自身的晶体特征被抑制。

2.3.4红外光谱（IR）研究应用IR法[16-17]对单体和药物的相互作用进行了研究。分别取葛根素、壳聚糖、葛根素/海藻酸钠/壳聚糖物理混合、Pur-CS/SA-NPs冻干粉各1mg，光谱纯溴化钾约mg，在环境温度25℃、湿度＜50%条件下，置于研钵中混合后研磨均匀，红外灯烘干后，将烘干的样品压制成片，后放入红外光谱仪光路中进行分析。结果见图4。

由IR图谱可知，葛根素-壳聚糖-海藻酸钠物理混合，基本上是峰的叠加，葛根素特征峰、、、cm?1依然存在，主要吸收峰的位置和强度并没有明显的变化，在自组装载药纳米粒中，葛根素特征峰、、、cm?1均发生了偏移且减弱，说明葛根素结构中的官能团与壳聚糖、海藻酸钠分子的某些部分发生了相互作用。Pur-CS/SA-NPs的IR图谱中壳聚糖吸收峰形状和宽度也发生了改变，葛根素在cm?1和cm?1附近的苯环吸收峰在Pur-CS/SA-NPs图谱中同样存在，但强度稍弱。IR光谱分析结果表明Pur-CS/SA-NPs中葛根素与壳聚糖、海藻酸钠的基本化学结构没有发生根本的改变，说明葛根素与壳聚糖、海藻酸钠之间无新的化学键的形成，并未形成新的化合物而是形成复合物，可以推测葛根素与壳聚糖、海藻酸钠之间可能有氢键或范德华力的形成。

2.4药动学研究

2.4.1动物分组与给药取SD大鼠18只，随机分为2组，葛根素组ig给予葛根素mg/kg，自组装法Pur-CS/SA-NPs组ig给予Pur-CS/SA-NPs（相当于葛根素mg/kg），实验前禁食，自由饮水。给药后在15、30、45min及1、1.5、2、4、6、8、12、24h时间点自眼眶静脉采血0.3mL，加肝素抗凝，4r/min离心10min，分离血浆置冰箱中保存[18-19]。

2.4.2血浆样品处理取μL血浆，加入μL色谱纯甲醇，μL内标（兰索拉唑），于涡旋混合器上涡旋振荡3min，15r/min离心10min，沉淀蛋白，取上清液全部转移至另一支离心管中后，45℃下氮气吹干，残渣加入μL色谱甲醇溶解后涡旋5min，于15r/min离心10min，取上清液进样，记录色谱图[20-21]。

2.5药动学方法学的建立

2.5.1LC-MS/MS条件

（1）液相色谱条件：色谱柱为AgilentZorbaxSB-C18柱（mm×2.1mm，5μm）；流动相为0.3%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱程序为0.00～1.00min，10%乙腈；1.00～2.00min，60%乙腈；2.00～4.00min，95%乙腈；4.10～6.00min，10%乙腈；体积流量0.30mL/min；进样量2μL。柱温30℃。

（2）质谱条件：离子源为电喷雾离子源，通过正离子扫描的方式进行扫描，通过多反应监测（MRM）的方式进行监测。电喷雾电压为5V，雾化气压力（GS1）为.kPa（45psi），气帘气压力（CUR）为.kPa（35psi），辅助气压力（GS2）为.kPa（50psi），离子源温度（TEM）为℃，优化后的葛根素与内标（兰索拉唑）的MRM参数见表2和图5。

2.5.2专属性取空白血浆加入葛根素对照品储备液，制成葛根素的血浆样品，按“2.4.2”项方法处理后，在“2.5.1”项条件下进样测定，结果显示并未出现干扰峰，血浆中内源性物质不干扰葛根素和内标的测定，说明该方法专属性较好，结果见图6。

2.5.3线性关系考察取空白血浆μL，加入葛根素系列对照品溶液，制成葛根素血浆样品质量浓度分别为5、10、20、40、80、ng/mL系列血浆样本，按照按“2.4.2”项方法进行操作，以峰面积为纵坐标（Y），葛根素质量浓度为横坐标（X），进行线性回归，得回归方程为Y＝0.7X＋0.，r2＝0.，表明在5～ng/mL下呈线性相关，葛根素的检测限为1.0ng/mL，定量限为5.0ng/mL。

2.5.4精密度考察分别取葛根素对照品储备液，稀释成10、20、40ng/mL3种质量浓度的葛根素对照品溶液，按“2.4.2”项方法处理和“2.5.1”项测定方法进行操作，分别于日内进样5次，考察日内精密度；每天同一时间进样1次，共进样5次，测得日间精密度RSD均小于3.00%，日间精密度均小于5.00%，表明精密度良好。

2.5.5回收率试验取葛根素对照品储备液，制成质量浓度分别为10、20、40ng/mL的葛根素对照品溶液，测定葛根素峰面积，另取血浆样品，配制成10、20、40ng/mL3种质量浓度的葛根素血浆样品，按照按“2.4.2”项方法处理，测定RSD。由结果可知，低、中、高3种质量浓度回收率RSD值依次为4.80%、3.12%、2.15%，均在5.00%以内，表明该方法准确度良好。

2.5.6稳定性试验制备低、中、高3种质量浓度（相当于葛根素血药浓度为10、20、40ng/mL）的血浆样品，按“2.4.2”项下方法操作，分别考察葛根素血浆样品?20℃冷冻保存，冻融循环3次，复融后血浆样品溶液室温放置6h，进样测定RSD为1.21%，表明稳定性良好。

2.6药动学参数的求算及数据处理

采用药动学软件（DAS2.0），将血药浓度测定结果输入软件，计算得出药动学参数。结果表明，Pur-CS/SA-NPs及葛根素均符合二室房室模型，药时曲线及主要药动学参数分别见图7和表3，Pur-CS/SA-NPs的药时曲线下面积（AUC0～24、AUC0～∞）、达峰时间（tmax）、达峰浓度（Cmax）分别是葛根素的3.、3.、2.、1.倍，表明所制备的Pur-CS/SA-NPs提高了葛根素在体内的吸收速率和吸收程度，明显提高了葛根素的生物利用度。消除半衰期（t1/2）也相对延长。结果表明天然聚阳离子壳聚糖和天然聚阴离子海藻酸钠在水溶液中的静电相互作用形成的聚电解质，延缓了葛根素的释放。

3讨论

采用天然聚阳离子壳聚糖和天然聚阴离子海藻酸钠，利用带相反电荷的聚电解质在水溶液中的静电相互作用制备的自组装Pur-CS/SA-NPs口服纳米粒，反应条件温和，易于制备，生物相容性良好，适用性广，为葛根素纳米粒的进一步研究奠定了良好的基础。

Pur-CS/SA-NPs的表征结果显示，在冷冻和解冻过程中，由于内外渗透压的改变，使得微粒裂解，粒径变大，但该纳米粒形态结构、理化性质稳定，若在冻干过程中加入合适的冻干保护剂，可对纳米粒的粒径进行保护使其免受影响。红外检测葛根素与壳聚糖、海藻酸钠之间的物理混合并没有发生化学反应，制备的纳米粒经过分析也没有新的化学键形成，可以推测葛根素与壳聚糖、海藻酸钠之间可能有氢键或范德华力形成，Pur-CS/SA-NPs形成的是复合物而非化合物。XRD显示纳米粒中葛根素的晶体衍射峰完全消失，葛根素已基本被包裹或吸附完全，其自身的晶体特征被抑制。故而纳米粒没有显示出晶体特效，以无定形特征存在的Pur-CS/SA-NPs的溶出要高于葛根素。

体内药动学研究显示Pur-CS/SA-NPs的相对生物利用度较葛根素原料药提高到3倍左右，显著改善了葛根素的生物利用度，且在体循环时间延长，结合课题组之前的体外释放实验，其释药过程符合Higuchi模型方程，且在释放过程中无突释现象，缓释效果相关一致，为葛根素口服纳米制剂的进一步研究提供了依据。

参考文献（略）

来源：李娜，颜洁，关志宇，朱卫丰，钟凌云，周冬艳．葛根素壳聚糖/海藻酸钠口服纳米粒的制备、表征与药动学研究[J].中草药,,51(15):-.