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DOI:10./j.apmt..

糖尿病溃疡等不同病理生理性溃疡引起的慢性创面的临床治疗仍然是一个瓶颈。尽管已经设计和开发了许多方法，但由于慢性难愈合伤口的病理微环境复杂，再生能力有限，其治疗效果无法满足医疗需求。本研究设计了一种由一层静电纺丝甲基丙烯酸明胶（MeGel）/聚L-乳酸（PLLA）径向取向纳米纤维垫（RNMs）和一层丹参-葛根复合物（SRHC）负载MeGel水凝胶构成的新型双层多功能敷料贴片，以促进糖尿病伤口的闭合和愈合。首次设计并采用一种创新型静电纺丝方法来生成MeGel/PLLARNMs，与传统的静电纺丝MeGel/PLLA不规则取向纳米纤维垫（HNMs）和MeGel/PLLA单轴取向纳米纤维垫（UNMs）相比，所制备的径向取向纳米纤维垫可有效引导人真皮成纤维细胞（HDFs）的迁移并促进其增殖。重要的是，与MeGel/PLLAHNMs和UNMs相比，体内小鼠急性全层皮肤缺损模型也证实了MeGel/PLLARNMs在提供细胞募集和调节能力的整个过程中可以显著促进细胞迁移并加快愈合速度。使用负载不同浓度SRHC的MeGel水凝胶前体在MeGel/PLLARNMs上生成水凝胶层，从而制备出一系列具有综合多功能特性的双层伤口敷料贴片。所有带有或不带有SRHC的双层伤口敷料贴片均显示出优异的止血性能。含有SRHC的双层敷料贴片对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有很好的抗菌性能，HDFs的存活率较高。在体内全层糖尿病伤口愈合试验中，与医用纱布相比，不含SRHC的双层敷料贴片的伤口愈合速度更快。此外，负载10%SRHC的双层敷料贴片通过有效减少炎症、促进血管形成以及毛囊再生，显著加快了糖尿病伤口的高质量再生和愈合。具体而言，10%SRHC负载双层敷料贴片在术后第18天呈现出97.4±2.8%的高愈合面积。综上，本研究表明含有SRHC的双层敷料贴片在治疗难愈合糖尿病伤口方面具有巨大的潜力。

图1.（A）通过改良静电纺丝技术和紫外交联后处理相结合的方法制备MeGel/PLLARNMs的示意图。自制静电纺丝装置采用一系列针环结构作为特殊的纳米纤维收集器。（B）HNMs、（C）UNMs和（D）RNMs模式的示意图。通过三种不同的静电纺丝基策略制成的（E）MeGel/PLLAHNMs、（F）MeGel/PLLAUNMs和（G）MeGel/PLLARNMs的SEM图像。比例尺：（E）和（F）为μm；（G）为μm。（H）MeGel/PLLAHNMs、UNMs和RNMs的平均孔径（n=3；n.s.表示两组之间没有显著差异）。（I）MeGel/PLLAHNMs、UNMs和RNMs的FTIR光谱。

图2.（A）三种不同膜样品的拉伸断裂过程示意图，包括MeGel/PLLAHNMs、UNMs和RNMs。（B）干态和（C）湿态的不同MeGel/PLLA膜样品的力学性能，包括杨氏模量、极限强度和失效应变（n=5；*p0.05，**p0.01，***p0.）。

图3.（A）位于MeGel/PLLARNMs中心的MeGel水凝胶液滴的细胞迁移过程示意图。（B）含有HDF的MeGel水凝胶液滴在圆形MeGel/PLLARNMs的中心交联和固化后，第3天和第7天F-肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）染色的荧光图像。比例尺=μm。（C）第7天在MeGel/PLLAHNMs、UNMs和RNMs上接种和培养的HDFs的F-肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）染色的荧光图像。比例尺=μm。（D）7天内在三种不同膜样品上接种和培养的HDFs的细胞活性定量测定（n=5，**p0.01，***p0.）。

图4.（A）对照组、MeGel/PLLAHNMs组、MeGel/PLLAUNMs组和MeGel/PLLARNMs组术后第3、6和9天的急性创面数码照片。（B）四个不同组的伤口收缩定量分析（n=3；*p0.05，**p0.01，***p0.01）。（C）术后第3、6和9天四个不同组的伤口闭合示意图。

图5.（A）双层敷料贴片的制备过程示意图，通过交联负载SRHC的MeGel溶液，在MeGel/PLLARNM顶部生成一层水凝胶。（B）不含SRHC的贴片、5%SRHC负载贴片和10%SRHC负载贴片的横截面形态SEM图像。比例尺=μm。（C）有无SRHC的三种不同双层敷料贴片的压缩模量，（D）压缩极限强度和（E）压缩失效应变（n=3；彼此之间没有显著差异）。（F）有无SRHC的三种不同双层敷料贴片的动态水溶胀率和（G）体外降解测定。

图6.（A）仅贴片、5%SRHC负载贴片和10%SRHC负载贴片的大肠杆菌抗菌活性和（B）金黄色葡萄球菌抗菌活性（n=3；*p0.05，**p0.01，***p0.）。（C）在仅贴片、5%SRHC负载贴片和10%SRHC负载贴片提取物中培养的HDF的细胞活性定量测量（n=5；n.s.表示两组之间没有显著差异）。

图7.（A）将仅贴片、5%SRHC负载贴片和10%SRHC负载贴片直接贴在受伤小鼠肝脏出血点的止血行为数码照片。（B）30秒后三个不同组的出血量（n=3；***p0.）。

图8.（A）对照组、仅贴片组、5%SRHC组和10%SRHC组术后第3、6、9、12、15、18天伤口部位的数码照片。（B）四个不同组的伤口收缩定量分析（n=3；*p0.05，**p0.01）。（C）术后第9、12、15和18天四个不同组的伤口闭合示意图。

图9.（A）术后第9天和第18天经医用纱布、仅贴片、5%SRHC贴片和10%SRHC贴片处理的再生皮肤组织的HE染色图像。比例尺=μm。黑色箭头代表再生的毛囊。（B）仅贴片组、5%SRHC组和10%SRHC组的毛囊定量分析。该值是相对于对照组而言的（n=3；*p0.05，**p0.01，***p0.）。

图10.（A）术后第18天经CD31（红色）和DAPI（蓝色）染色的伤口部位再生皮肤组织的荧光图像。比例尺=50μm。（B）仅贴片组、5%SRHC组和10%SRHC组的CD31强度的定量分析。该值是相对于对照组而言的（n=3；*p0.05，**p0.01）。

图11.（A）术后第3天经CD80（绿色）、CD（红色）和DAPI（蓝色）染色的伤口部位再生皮肤组织的荧光图像。比例尺=20μm。（B）对照、仅贴片组、5%SRHC组和10%SRHC组的CD强度/CD80强度的定量分析。第3天使用ELISA试剂盒对伤口部位皮肤组织的（C）TNF-α浓度和（D）IL-6浓度进行定量分析。（n=3；*p0.05，**p0.01，***p0.）

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