北京中科白瘕风 http://news.39.net/bjzkhbzy/171129/5887992.html

摘要：目的采用Box-Behnken效应面法筛选壳聚糖/海藻酸钠自组装制备葛根素纳米粒（Pur-NPs）的最优处方。方法采用自组装法制备葛根素壳聚糖/海藻酸钠纳米粒（Pur-CS/SA-NPs），以壳聚糖质量浓度、壳聚糖pH值、海藻酸钠质量浓度、搅拌速度、搅拌时间、超声功率、投药量为考察因素，以包封率、载药量、粒径、多分散指数（PDI）为评价指标，进行单因素考察，利用Box-Behnken效应面设计法筛选最优处方，将最优处方进行表征及体外释放实验。结果得到优化后自组装法最优的处方为壳聚糖质量浓度0.45mg/mL，海藻酸钠质量浓度为0.07mg/mL，壳聚糖pH值4.33，转速.49r/min。为了实验操作方便，将最优处方定为壳聚糖质量浓度0.45mg/mL，海藻酸钠质量浓度为0.07mg/mL，壳聚糖pH值为4.3，转速r/min，平行3次实验进行验证，所得纳米粒包封率（89.±1.）%、载药量（44.±0.）%、平均粒径（.±1.）nm、PDI0.±0.。经过表征，纳米粒形态完好，由体外释放实验可知，纳米粒经过拟合所符合的方程为Higuchi模型，且在释放过程中无突释现象，表明纳米粒在体外释放良好。结论采用Box-Behnken效应面法优化了Pur-CS/SA-NPs的处方，以平均粒径、PDI、包封率、载药量为指标评价该模型，且经过表征及体外释放实验，表明该模型预测性良好。

葛根素（puerarin，Pur）是豆科植物野葛Puerrarialobata(Willd.)Ohwi的主要有效成分，具有多种生物学作用，在临床各领域应用广泛，主要可缓解冠心病心绞痛，辅助治疗心肌梗死[1-2]、脑梗死[3]、突发性耳聋[4]，促进神经功能恢复[5-8]。Pur为BCSIV类药物，口服生物利用度低，目前临床上只有注射液和滴眼液，前者需长期用药，患者使用顺应性差，且易发生血管内溶血[9-10]、过敏性哮喘、过敏性休克、发热等不良反应[11-14]。口服给药是最易被接受的给药途径，可自主用药，且不直接损害皮肤和黏膜[15-16]，安全性好，因此新型口服给药系统已成为目前Pur研究的热点。本实验采用天然聚阳离子壳聚糖（CS）和天然聚阴离子海藻酸钠（SA），通过自组装法制备葛根素壳聚糖/海藻酸钠纳米粒（Pur-CS/SA-NPs），自组装法是利用带相反电荷的聚电解质在水溶液中通过静电相互作用，以自组装形成壳聚糖-海藻酸盐纳米粒（CS/SA-NPs）[17-18]。且两者都是无毒、生物相容性好的天然高分子材料，反应条件较为温和[19-20]，所制备的纳米粒无突释现象。本实验通过单因素考察、Box-Behnken效应面法优化制备Pur-CS/SA-NPs，以期提高Pur生物利用度，为Pur新剂型的研究、临床应用及产业化生产奠定基础。

1仪器与材料

SQP万分之一分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Nano-S马尔文纳米粒度仪，英国马尔文公司；AgilentA高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；ZNCL-BS*磁力搅拌器，西安远舰仪器设备有限公司；TECNALG2透射电子显微镜，美国FEI公司；KQDA超声仪，昆山市超声仪器有限公式；PHS-25pH校准计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

Pur对照品，中国食品药品检定研究院，批号-，质量分数＞95.5%；Pur，成都普菲德生物技术有限公司，批号，质量分数＞98%；CS，实验室自制，脱乙酰度＞99%；SA，AlfaAesar公司，批号；无水氯化钙，国药集团化学试剂有限公司，批号；胰蛋白酶（CAS：-07-7），Solarbio公司，批号E；胃蛋白酶（CAS：-75-6），Solarbio公司，批号A。

2方法与结果

2.1自组装法制备Pur-CS/SA-NPs

2.1.1储备液的配制分别称取SA、氯化钙、CS.0mg于10mL量瓶，用水定容至刻度，超声溶解放至冰箱储存。

2.1.2制备方法精密量取CS储备液溶液μL置5mL量瓶中用纯水定容至刻度线，用1%的稀盐酸和饱和氢氧化钠溶液调节CS溶液pH值，精密称取Pur10.0mg于5mL量瓶中，用5%的乙醇溶液定容至刻度线，将Pur溶液加入CS溶液中，搅拌混合均匀。另取25mL烧杯，加入SA储备液50μL、氯化钙储备液μL，加入9.85mL纯水，在磁力搅拌器下搅拌10min混合均匀后超声10min，将Pur/CS溶液通过1mL注射针管缓缓滴入SA/氯化钙混合溶液中，滴加完全后超声10min，超声后将混悬液在磁力搅拌器下搅拌一定时间，至溶液显明显乳光。

2.2Pur-CS/SA-NPs分析方法的建立

2.2.1供试品溶液的配制取“2.1.2”项下方法制备的Pur-CS/SA-NPs混悬液1mL于10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度线，即得供试品溶液。

2.2.2对照品溶液的配制精密称取Pur对照品10.0mg于10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度线，即得质量浓度为1.0mg/mL的对照品溶液。

2.2.3色谱条件色谱柱为AgilentTC-C18柱（mm×4.6mm，5μm），流动相甲醇-水（30∶70），体积流量1mL/min，进样量10μL，柱温30℃，理论塔板数以Pur峰计为。

2.2.4专属性考察分别取Pur对照品溶液、自组装法制备的Pur-CS/SA-NPs、空白纳米粒，过0.22μm微孔滤膜，在“2.2.3”项色谱条件下进行HPLC测量。由图1可知，Pur-CS/SA-NPs混悬液与对照品溶液相比在相同的保留时间处出现色谱峰，空白纳米粒样品溶液未出现色谱峰，故认为空白纳米粒对实验无干扰作用。

2.2.5线性关系考察精密量取1.0mg/mLPur对照品溶液0.、0.、0.、0.、0.60、0.mL，分别置于10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度线，按“2.2.3”项色谱条件测定，记录色谱图。以Pur色谱峰面积作为纵坐标（Y），质量浓度作为横坐标（X）进行线性回归，计算回归方程及相关系数（r2），得标准曲线为Y＝91.X＋35.，r2＝0.，表明Pur在0.～0.mg/mL呈良好的线性关系。

2.2.6精密度试验取低、中、高（0.、0.、0.mg/mL）3个质量浓度的Pur对照品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，每一质量浓度测定6次，记录其峰面积，计算精密度。结果表明Pur峰面积RSD值为0.47%，说明该方法的精密度良好。

2.2.7稳定性试验取“2.2.1”项下供试品溶液，按照“2.2.3”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、18、24h进样分析，计算得Pur的峰面积RSD值为0.33%，说明所制备的纳米粒稳定性良好。

2.2.8重复性试验按照“2.1.2”项平行制备6份样品，并按“2.2.1”项制备供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件进行，计算得Pur质量分数的RSD值为0.47%，结果表明该方法重复性良好。

2.2.9加样回收率试验精密量取1mL“2.2.1”项下供试品溶液9份，分为3组，分别加入Pur对照品溶液，得到加样质量浓度分别为低、中、高（0.、0.、0.mg/mL）的溶液，按“2.2.3”项下色谱条件进行，计算回收率和RSD，测得回收率均在99.77%～.95%，RSD均小于1.5%，结果表明该方法符合测定要求。

2.3包封率和载药量的测定

取Pur-CS/SA-NPs混悬液μL置超滤离心管，于10r/min高速离心30min后取截留液，经0.22μm滤膜滤过。精密量取续滤液μL，甲醇定容至10mL，混匀，按“2.2.3”项色谱条件进行测定。

包封率＝(C－C1)/C

载药量＝W1/(W1＋W2)

C为混悬液中总的Pur的质量浓度，C1为混悬液中未包封的药物的质量浓度，W1为包封的药物的质量，W2为所有辅料的质量

2.4单因素考察

在上述储备液的基础上，分别考察CS质量浓度为0.2、0.4、0.8、1.0、1.5mg/mL，CSpH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，SA质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，氯化钙质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，搅拌速度为、、、、r/min，超声时间为0、2、4、6、8、10min，超声功率为50、60、70、80、90、kHz，搅拌时间为10、30min及1.0、1.5、2.0h，投药量为5、10、15、20、25mg对Pur-CS/SA-NPs的粒径、PDI、包封率、载药量的影响。

通过单因素考察发现，CS质量浓度、CS溶液pH值、SA质量浓度、搅拌速度这4个因素是影响粒径、PDI、包封率和载药量的最显著因素，故对这4个因素进行优化试验。其他单因素对纳米粒的影响如下：少量Ca2+可使纳米粒粒径降低，但浓度过大会使混悬液有明显絮状物。短时间超声可使粒径降低，但对包封率和载药量的影响并不是很大，超声时间在10min后，对纳米粒的粒径、PDI等均无影响。超声功率越大纳米粒的粒径越小，且超声功率在90kHz之后对纳米粒粒径等均无影响。搅拌有助于混悬液分散，时间越长所制备的Pur-CS/SA-NPs越佳。当投药量超过10mg时，Pur-CS/SA-NPs的包封率和载药量并没有显著性提高或降低，故Pur投药量定为10mg。综合单因素考察结果，氯化钙质量浓度为0.05mg/mL，超声时间为10min，超声功率90kHz，搅拌时间1.5h，投药量10mg，所得纳米粒粒径和PDI最低，且包封率和载药量最大。

2.5Box-Behnken效应面法优化处方

依据单因素实验结果，采用Box-Behnken效应面法对自组装法制备Pur-CS/SA-NPs进行处方优化，选取因素A（CS质量浓度）、B（SA质量浓度）、C（CS溶液pH值）、D（转速），试验设计见表1。

根据DesignExpert8.0.6软件，将平均粒径、多分散系数（PDI）、包封率、载药量每个指标定为0～1的归一值，各指标归一值求几何平均数，得总评归一值（OD），按公式OD＝(d1d2…dk)1/k进行计算，k为指标数[21-22]。对于包封率、载药量取值越大越好，平均粒径、PDI取值越小越好的因素分别采用Hassan方法，然后分别转换求得归一值dmax和dmin公式如下[23]。自组装法Box-Behnken效应面法试验结果见表1，所得OD值各因素方差分析结果见表2。

dmax＝(Yi－Ymin)/(Ymax－Ymin)

dmin＝(Ymax－Yi)/(Ymax－Ymin)

应用DesignExpert8.0.6软件以A、B、C、D为自变量，OD值为因变量，进行2次多项式逐步回归拟合，得到方程：OD＝0.＋0.A－0.B－0.C＋0.D＋0.AB＋0.AC－0.AD－0.BC－0.BD＋0.CD－0.A2－0.B2－0.C2－0.D2（r2＝0.，P＜0.），其等高线图与3D曲线图见图2。

Box-Behnken效应面试验设计结果，得到优化后自组装法最优的处方为CS质量浓度0.45mg/mL，SA质量浓度0.07mg/mL，CS溶液pH值4.33，转速.85r/min。

2.6最优处方验证试验

根据Box-Behnken效应面优化试验，得到最佳处方，将最佳处方平行3次实验进行验证。为了操作方便，将最优处方定为CS质量浓度0.45mg/mL，SA质量浓度为0.07mg/mL，CS溶液pH值为4.30，转速r/min，所得各评价指标与预测值接近，表明建立的回归方程预测性良好，结果见表3。

2.7Pur-CS/SA-NPs的表征

取Pur-CS/SA-NPs混悬液适量，滴入载玻片上，缓慢盖上盖玻片，防止产生气泡。调节显微镜，使得偏光角度为90°，视野为暗黑色，将样品玻片置入电子显微镜中观察。取稀释10倍的样品10μL滴在覆有支持膜的铜网上，静置5min后用滤纸吸干，再滴加0.5%磷钨酸溶液10μL于铜网上染色5min，静置挥干后置于透射电镜下观察。在电子显微镜和透射电镜下显示，纳米粒呈现圆形，且粒径分布均匀，大小均一。结果见图3。

2.8Pur-CS/SA-NPs体外释药实验

分别以人工胃液（SGN）和（SIF）为释放介质，采用透析法测定Pur-CS/SA-NPs的体外释药行为[24]。将Pur-CS/SA-NPs混悬液精密量取2mL置透析袋（截留相对分子质量3）中，将Pur溶液量取同样质量置于透析袋内，并扎紧两端，置装有释放介质mL的烧杯中，在（37.0±0.5）℃、r/min振荡条件下实验。分别于0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12、24h取样1mL，同时补充同温同量介质，经0.22μm微孔滤膜滤过后测定，计算药物质量浓度和累积释放率（Q）。

Qn为第n个时间点药物的Q，Cn为第n次取样时由标准曲线方程得到的各Pur质量浓度，V为释放介质的总体积，Vi为取样的体积，M为透析袋内Pur的质量

根据模拟SGN和SIF，测定Pur和Pur-CS/SA-NPs在体外的累积释放率，结果见图4和表4。

由上述结果可知，Pur原料药在SIF和SGN中8h的Q达99%，在后续释放接近平稳，Pur-CS/SA-NPs在SIF和SGN中在8h后依然持续有释放，经过拟合所符合的方程为Higuchi模型，且在释放过程中无突释现象，表明Pur-CS/SA-NPs在体外释放良好。

3讨论

口服缓释纳米粒是新一代亚微粒给药系统，Pur缓释纳米粒生物利用度高，毒性低、生物相容性较好，可较好地控制药物释放[25]。

CS是阳离子聚合物，因其具有生物可降解性、生物相容性及靶向性等特点，已成为纳米药物载体的研究热点[26-27]，本实验采用的CS为自制水溶性CS，脱乙酰度≥99%。

SA是一种天然亲水性胶体多糖的高分子材料，含有许多游离羟基（-OH）和羧基（-COOH），相邻的-COOH可以很容易地与Ca2+结合形成海藻酸钙明胶（CA）[28-29]。加入少量的Ca2+有利于CS-SA形成复合粒子，Ca2+与CS可以进一步通过静电作用，使纳米粒的粒径变更小；而当Ca2+浓度持续增加时，更多的SA分子与Ca2+形成分子间复合作用，使纳米粒产生凝胶化现象[30-31]。在制备纳米粒时，SA和氯化钙溶液要分别稀释后再混合均匀，高浓度下SA和氯化钙溶液混合后有明显絮状物且溶液不澄清，故在实验过程中要充分考虑SA和氯化钙的浓度及比例，使纳米粒的粒径达到最佳。

本实验以CS和SA为主要材料，采用自组装法制备Pur-CS/SA-NPs具有工艺简单，无污染等优点但粒径控制是其主要技术难点。经过单因素考察，CS质量浓度、CS溶液pH值、SA质量浓度、氯化钙质量浓度等因素均会影响Pur-CS/SA-NPs的制备。在制备纳米粒过程中，向SA/氯化钙混合溶液中加入CS溶液的速度不宜过快，否则容易产生絮状物，而导致纳米粒粒径增大。课题组采用缓慢滴加超声分散的方式，有效地实现粒径控制，且PDI、包封率、载药量均较好。随后进行Box-Behnken效应面实验设计，得到最佳Pur-CS/SA-NPs处方组成。通过处方验证实验表明，实测值与预测值之间的偏差的绝对值较小，且对优化后的纳米粒进行表征和体外释放试验，结果显示纳米粒形态完整且具有缓释效果，表明所建立的模型良好。

本实验通过制备口服Pur-CS/SA-NPs，在此研究的基础上，本课题将进一步研究所制备口服纳米粒在动物体内吸收及药物动力学，以考察其体内缓释效果和体内外相关性，以期促进Pur新剂型的进一步开发。

参考文献（略）来源：颜洁，关志宇，朱卫丰，钟凌云，吴文婷，邹斌，李娜，陈鸿.Box-Behnken效应面法优化自组装法制备葛根素壳聚糖/海藻酸钠口服纳米粒的处方与工艺研究[J].中草药,,50(23):-.预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇